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Artemia: determinación de la eficiencia de eclosión (EE)

por Javier Guerra

Objetivos: 

• Familiarizarnos con el método de conteo

• Comprobar la dispersión de los datos obtenidos individualmente

Eficiencia de eclosión: número de nauplius nacidos de un gramo de quistes incubados

Condiciones de incubación: las que utilice cada uno habitualmente 

Metodología:

1. Incubación de los quistes. Agregar 1 gramo de quistes en un litro de medio de incubación y anotar las condiciones de cultivo, así como la hora en que han sido puestos agua.

2. Al cabo de 48 horas tomar 0.2 ml del medio de incubación y colocarlo en una placa de petri. Para extraer el medio, usar una jeringuilla hipodérmica a la que le habremos quitado la aguja previamente, introducirla en el recipiente de incubación en la zona central  a una profundidad de unos 2 cm recogiendo la cantidad indicada. Levantar el émbolo a velocidad constante y no demasiado rápido (tardando para ello unos 2 ó 3 segundos.)

3. Agregar 2 ó 3 gotas de lugol. En unos pocos minutos los nauplius ya se habrán fijado por lo que pueden contarse sin problemas.

4. Contar los nauplius contenidos en la muestra. Contar sólo los que hallan eclosionado totalmente. En ellos se aprecian los apéndices (1 par de anténulas, 1 par de antenas y un par de mandíbulas).

5. Para calcular la EE:

Multiplicar el número de nauplius contados por 5000, de este modo se obtienen los nauplius contenidos en un litro, y como hemos puesto 1 gramo de quistes, serán por tanto los nauplius obtenidos por gramo de quistes.

Ejemplo:   23 nauplius en 0.2 ml, luego:

EE: 23 x 5000 = 115000 nauplius/gramo

6. Esta operación habrá que hacerla por quintuplicado, esto es, tomar 0.2 ml cinco veces (una tras otra sin que transcurra mucho tiempo), y colocarlos en placas de petri por separado para realizar el conteo individualmente, o bien en la misma placa si es de suficiente tamaño siempre que no entren en contacto las muestras.

Rellenar la siguiente tabla con las condiciones de incubación y los datos obtenidos: 

La aireación se da por hecho que será fuerte, aunque esto es bastante relativo.

Algunas consideraciones:

• En la jeringuilla hipodérmica se puede hacer alguna marca que nos facilite ver cuando hemos obtenido el volumen deseado de muestra.

• Es preferible usar placas de petri de plástico, ya que en este material la muestra no se dispersa tan fácilmente como en el vidrio, pudiéndose se este modo contabilizar los nauplius con mayor facilidad. Si andamos con cuidado, la muestra (habiendo agregado el lugol) ocupa una superficie aproximada de un círculo de 2 cm de diámetro.

• Para contar los nauplius se puede usar una lupa cuentahílos (con la que he hecho la prueba creo que es de 10X, hay una foto más abajo), o mejor aún con lupa binocular. Con el microscopio también se puede hacer el conteo, pero usando el objetivo de menor aumento se obtiene un aumento de 40X, con el que no se puede abarcar todo el campo. Para contar hay que diseñar algún sistema (líneas guía pintadas en la placa o portaobjetos, graduación de la platina,...) que nos permita rastrear toda la muestra.

• Para el conteo hay que tener en cuenta sólo los nauplius en los que se diferencia la silueta típica (con los apéndices). Cuando el naupliu sale del corion (cáscara), lo hace envuelto en una membrana (ectodermo extraembrionario), de la que más tarde se desprende. Cuando todavía posee esta membrana, ya se ve el color anaranjado, pero no se aprecia ningún tipo de apéndice, tiene una silueta como de “gota de agua cayendo”. En este estado podemos ver los nauplius bien sueltos o bien asociados al corion (ver esquema).

• El lugol es una solución muy común que contiene yodo. En caso de no tener lugol, supongo que la fijación se podrá hacer con etanol, aunque el primero es mejor por dar algo de color a los nauplius, facilitando así el conteo.

Placa de petri desechable, lupa cuentahílos y jeringa hipodérmica